COVID-19’un Akciğerlerdeki Tahribatının Moleküler Temeli

ABD Enerji Bakanlığı’nın Brookhaven Ulusal Laboratuvarı’nda çalışmalarını sürdüren bilim insanları, SARS-CoV-2 zarf proteininin moleküler modelini yayınlamışlardır. Akciğer zarını korumakla görevli insan proteinleri ile söz konusu zarf proteinlerinin nasıl etkileşime girdiğini açıklayan bu model, Nature Communications dergisinde kendine yer bularak virüsün akciğer hasarındaki rolünün anlaşılmasında rol oynamıştır. Bulguların COVID-19 ilaç çalışmalarını hızlandırabileceği öngörülmektedir.¹

SARS-CoV-2 virüs-konakçı ilişkisinde protein tanıma mekanizmasının yapısal temelini anlamak amacıyla, insanda hücre bağlantı proteini olan PALS1 ve SARS-CoV-2 viral zarf proteinin (E) kompleks yapısını saptamak için kriyojenik elektron mikroskopisi (cryo-EM) kullanılmıştır. Raporlanan yapının gösterdiği üzere E’nin C terminalinde yer alan DLLV motifi, PALS1’in PDZ ve SH3 domainlerinde yer alan ve özellikle hidrofobik karakter gösteren rezidülerin oluşturduğu cep yapısını tanımaktadır. Yapısal analizde viral E proteininin, akciğer epitel hücrelerinin bağlantı bölgelerinden PALS1’i topladığı gözlenmiştir. Ayrıca yapı, E virülansını azaltmak amacıyla PAL1-E etkileşimini ortadan kaldırabilen peptit ve küçük molekül inhibitörlerine yönelik yeni hedefler sunmaktadır.²

Ciddi Akut Solunum Yolu Sendromu Koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), insan sağlığını ve küresel ekonomiyi olumsuz etkileyen COVID-19 pandemisinin sorumlu etmenidir. Virüs, 3 milyondan fazla ölüme ve 160 milyondan fazla vakaya yol açmıştır. Ölümlerin çoğuna, akut solunum sıkıntısı sendromu ve virüs kaynaklı hiperimmün tepkilere bağlı doku hasarı neden olmaktadır.³

SARS-CoV-2 ve SARS-CoV-1 genomları; tutunma, bırakma ve viral hayat döngüsünün virülans fazları için kritik öneme sahip olan küçük bir zarf proteinini (E) kodlar.⁴ E, iki ayrı domaine sahip 75 aminoasit rezidüsünden oluşmaktadır: C-terminali domaini ve onun tarafından takip edilen transmembran (TM) N-terminali domaini. Çok işlevli olan E, viral etkileşimi sağlamak için viral membran proteiniyle (M) işbirliği yaparak membran eğimini indüklemektedir. Bu yapısal işlevinin yanı sıra, gözenek oluşturan TM domainiyle NLRP3 enflamasyonunu aktive etmek⁵ ve C-terminal domainiyle PDZ bağlamak gibi konakçının bağışıklık tepkilerine müdahale eden rolleri vardır^6,7. SARS-CoV-2 E TM domaini, SARS-CoV-1 ile benzer olarak pentamerik iyon kanalı yapısı oluşturmaktadır^8,9. Yine de muhtemelen yeterince stabil bir yapı olmaması nedeniyle C-terminal domaini iyi tanımlanmış bir yapıya sahip değildir².

İnsanlarda bir veya daha fazla PDZ domainini kodlayan ~150 farklı protein vardır. Bu PDZ domainleri 80-110 aminoasit rezidüsüne sahip olup insanların bağışıklık sistemi yanıtlarını, birçok fizyolojik ve patolojik aktiviteyi yönetmek için elzemdir. Hücre bağlantılarında yer alan ve PDZ domaini içeren proteinler, çeşitli virüsler tarafından virülanslarını arttırmak amacıyla gasp edilmektedir¹⁰. Hem SARS-CoV-2 hem de SARS-CoV-1 E proteinleri, C terminalinde birer PDZ bağlama motifi (PBM) barındırmaktadır. Aslında mekanizma tam anlamıyla bilinmese de PBM ve PALS1 etkileşimi bize E’nin PALS1’in aslında bulunduğu hücre birleşiminden, E’nin yer aldığı endoplazmik retikulum-golgi ara bölgesine (ERGIC) yer değiştirdiğini ve bu şekilde viral birleşmeyle olgunlaşmanın gerçekleştiğini anlatmaktadır.⁶

PALS1; Crumbs, PALS1 ve PATJ’den oluşan bir apikal hücre polarite kompleksinin ayrılmaz bir parçasıdır.¹¹ Fizyolojik koşullarda PALS1, Crumbs C-terminaliyle (Crb-CT) PSG kısmı aracılığıyla¹² ve PATJ N-terminal L27 domainiyle etkileşmektedir¹³(Şekil 1a). SARS-CoV2 ile enfekte olan akciğer epitelinde virüs genomunun replikasyonu ve transkripsiyonunun yapılması, viral birleşme ve tomurcuklanma için ERGIC bölgesinde bulunan E proteini miktarını arttırmaktadır¹⁴. E ve PALS1 arasındaki belli etkileşimlerin PALS1’i virüslerin lokalize olduğu bölgeye topladığı ve bu şekilde polar kompleksle vasküler yapıyı bozabileceği öne sürülmektedir.⁶ Bunun sonucunda epitel hücrelerinin bağlantıları gevşeyerek sızdırmaya başlamaktadır. Sızdıran bağlantılar viral yayılmayı, sıvı akışını ve monositlerle nötrofiller gibi bağışıklık hücrelerinin alveolar boşluklara dolmasını teşvik edebilmektedir(Şekil 1b). PALS1’e ek olarak E, syntenin⁷, ZO-113¹⁵ ve diğer hücre bağlantı proteinlerini içeren PDF ile etkileşime girmektedir.¹⁶Akciğer epitel hücrelerinin bağlantı proteinlerinin yer değiştirmesi vasküler sızıntıya, alveolar hasara, sitokin fırtınası başlangıcına ve akut solunum yolu sıkıntısına (ARDS) olabilmektedir. Sonuç olarak yaşlılar ve altta yatan koşulları olan hastaların durumu ölümle sonuçlanabilmektedir.⁴

E’nin içerdiği PBM’de, SARS-CoV-2 ve SARS-CoV-1 arasında korunmuş olan 4 rezidü (DLLV) vardır. PBM’siz mutantlar zayıf ya da ölü olduğu için motifin virülansta kritik rol oynadığı anlaşılmaktadır.^7,17 Yapısal bilgi eksikliği, E aracılı virülansın mekanizmasını protein-protein etkileşimi bakımından anlaşılmasını zorlaştırmaktadır. Bu çalışmada E proteininin C-terminalinde yer alan PBM ile PALS1’in PDZ ve SH3 alanlarının etkileşim mekanizması aydınlatılmak için PALS1-E kompleksinin yapısı tanımlanmıştır.²

PSG-Ec18 Kompleksinin Üretimi

PALS1, ikisi N-terminal L27 domaini ve üçü PDZ, SH3 ve GK’dan oluşan (PSG olarak adlandırılır) C-terminal domaini olmak üzere beş domain barındırmaktadır. Protein kararlılığı arttırılmak için SH3 ve GK domainleri arasında tekrar olmadan PSG (236-675 rezidüleri) ekspresyonu ve saflaştırılması yapılmıştır(Şekil 2a). Eksprese edilen protein, Ni-NTA (nikel nitrilotriasetik asit) eğilimli reçineler ve ardından boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırılmıştır(Şekil 2b). SEC yöntemiyle PSG’nin çoğunun dimer olduğu analiz edilmiştir²(Şekil 2c).

PALS1 PSG ve SARS-CoV-2 E C-terminal domaininin yapısal temelini çalışmak için PBM içeren 18 aminoasitlik bir E C-terminal peptidi (Ec18) sentezlenmiştir. İkisi arasındaki bağlanma eğilimini kontrol etmek için PSG bir floresan boya kullanılarak etiketlenmiş ve Ec18 seyreltisi kullanılarak titre edilmiştir. Mikro ölçekli termoforez (MST) yöntemiyle yapılan analizin sonucunda K_d, 11.2 µM olarak belirlenmiştir(Şekil 2d). Ölçülen değer K_d, 40 µM olarak 10 aminoasitlik peptitle PDZ alanının kullanımıyla gözlenen bağlanma eğilimi için tutarlıdır. Ec18 ve PSG arasındaki düşük eğilim nedeniyle yüksek oranda Ec18 kullanılmıştır.²

Yapıyı Belirleme

PSG-Ec18 kompleksi, tek partikül cryo-EM ile analiz edilmiştir. Ek görünümler elde etmek için deterjan taraması yapılmış ve %0,05 CHAPS eklenmesinin birden çok görünüm sağladığı anlaşılmıştır(Şekil 1b,e). Tekrarlayan 2D ve 3D sınıflandırmalar ve iyileştirmeler, CTF’nin ve Relion3 ve CryoSPARC’la Bayes cilanın(Şekil 3) uygulanmasıyla 3.65 Å(Şekil 1c) yapılandırması sonucuyla elde edilmiştir.²

PSG–Ec18 Kompleksinin Yapısı

Çözülen yapı bir PSG dimeri ve tek Ec18 içermektedir(Şekil 2a). Bir PSG monomerinde PDZ, SH3, ve GK domainleri gözlenmekteyken diğer monomerde PDZ domaini kaybolmuştur. Bu 3D sınıflandırmada eksik PDZ alanında düzensiz bir bölgeye rastlanmıştır ve bu durum PSG-Ec18 etkileşimlerinin geçici ve dinamik olduğunu düşündürmüştür²(Şekil 3).

Elde edilen yapıda Ec18, PDZ ve SH3 alanlarının arasındaki hidrofobik cep yapısına PBM (72DLLV75)(Şekil 2b, c) ile yerleşmiştir.²

Yapının PSG–Crb-CT Kompleksiyle Karşılaştırılması

Ec18 ve PALS1’in bağlanma eğilimi, PALS1’in fizyolojik ligandı olan Crb-CT ile olan etkileşiminden daha zayıftır¹². Bu nedenle viral E proteini, PALS1’e bağlanma veyerleşme için Crb-CT ile rekabet eder⁶. Ec18-PALS1 etkileşiminin yapısal temelini ve bunun virülansla olan ilgisini anlamak için bu kompleks, PSG-Crb-CT kompleksinin (PDB kodu 4WSI) X-ışını yapısıyla karşılaştırılmıştır. Ec18 yalnızca PDZ ve SH3 domainleriyle etkileşim gösterirken Crb-CT üç domainle de etkileşmektedir. PSG–Ec18 ve PSG–Crb-CT yapılarının hizalanmalarına bakılarak Crb-CT terminal izolösininin PDZ cep yapısına derin bir şekilde saplanmış olduğu anlaşılmaktadır². SARS CoV-2 varyantları konakların evrimi sonucunda viral uygunluk ve virülans kazanmak amacıyla PBM’de (72DLLV75) mutasyonlar geçirmişlerdir^18,19. Bu nedenle Crb-CT ve viral PBM mutasyonları içeren bir hibrit peptit inhibitörünün PALS1-E etkileşimlerini zayıflatacağı ve E aracılı virülansı bastıracağı öngörülmektedir².

Sonuç

İnsanda E proteini bulunduran yedi çeşit koronavirüs vardır (hCoVs). Ancak yalnızca üçü (SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, ve MERS-CoV) E aracılı virülansa sahiptir⁴. Yedi hCoV E proteinin çoklu dizi analizi hepsinin terminal hidrofobik rezidü sahibi olduğunu göstermiştir. En güçlü virülansa sahip olan SARSCoV-1 ve SARS-CoV-2, dört rezidülü PBM dizisi DLLV’yi barındırmaktadır. DLLV motifi MERS-CoV ve diğer hCoV türlerinde görülmemektedir. Yapıda da görülebilen, DLLV motifinden hemen önceki rezidüler, Ec18 esnekliğini, çözünürlüğünü ve PALS1’e olan eğilimi modüle edebilmektedir. Bu nedenle, araştırmacılar, E aracılı PDZ bağlanmasını ve virülansı azaltmak için daha uzun peptitler tasarlamayı ve geliştirmeyi önermektedirler².

Kaynak

1. Wang, L. How COVID-19 wreaks havoc on human lungs. 19–22 (2021).

2. Chai, J. et al. Structural Basis for SARS-CoV-2 Envelope Protein in Recognition of Human Cell Junction Protein PALS1. bioRxiv 2021.02.22.432373 (2021) doi:10.1038/s41467-021-23533-x.

3.Mehta, P. et al. COVID-19: consider cytokine storm syndromes and immunosuppression. Lancet395, 1033–1034 (2020).

4.Schoeman, D. & Fielding, B. C. Is There a Link Between the Pathogenic Human Coronavirus Envelope Protein and Immunopathology? A Review of the Literature. Front. Microbiol. 11, 1–11 (2020).

5.Nieto-Torres, J. L. et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus E protein transports calcium ions and  activates the NLRP3 inflammasome. Virology 485, 330–339 (2015).

6.Teoh, K.-T. et al. The SARS coronavirus E protein interacts with PALS1 and alters tight junction  formation and epithelial morphogenesis. Mol. Biol. Cell 21, 3838–3852 (2010).

7.Jimenez-Guardeño, J. M. et al. The PDZ-binding motif of severe acute respiratory syndrome

8.Schoeman, D. & Fielding, B. C. Coronavirus envelope protein: current knowledge. Virol. J. 16, 69 (2019).

9.Mandala, V. S. et al. Structure and Drug Binding of the SARS-CoV-2 Envelope Protein in Phospholipid  Bilayers. Research square (2020) doi:10.21203/rs.3.rs-77124/v1.

10.Christensen, N. R. et al. PDZ Domains as Drug Targets. Adv. Ther. 1800143, 1800143 (2019).

11.Wells, C. D. et al. A Rich1/Amot complex regulates the Cdc42 GTPase and apical-polarity proteins in  epithelial cells. Cell 125, 535–548 (2006).

12.Li, Y. et al. Structure of Crumbs tail in complex with the PALS1 PDZ-SH3-GK tandem reveals a  highly specific assembly mechanism for the apical Crumbs complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.111, 17444–17449 (2014).

13.Roh, M. H. et al. The Maguk protein, Pals1, functions as an adapter, linking mammalian homologues of  Crumbs and Discs Lost. J. Cell Biol. 157, 161–172 (2002).

14.Wong, N. A. & Saier, M. H. J. The SARS-Coronavirus Infection Cycle: A Survey of Viral Membrane Proteins, Their  Functional Interactions and Pathogenesis. Int. J. Mol. Sci. 22, (2021).

15.Shepley-McTaggart, A. et al. SARS-CoV-2 Envelope (E) Protein Interacts with PDZ-Domain-2 of Host Tight Junction  Protein ZO1. bioRxiv : the preprint server for biology (2020) doi:10.1101/2020.12.22.422708.

16.Durbesson, F., Rezelj, V. V & Dinh, Q. Host PDZ-containing proteins targeted by SARS-CoV-2. 1–15 (2021) doi:10.1111/febs.15881.

17.Castaño-Rodriguez, C. et al. Role of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Viroporins E, 3a, and 8a in  Replication and Pathogenesis. MBio 9, (2018).

18.Hassan, S. S., Choudhury, P. P. & Roy, B. Molecular phylogeny and missense mutations at envelope proteins across  coronaviruses. Genomics 112, 4993–5004 (2020).

19. Rahman, M. S., Hoque, M. N., Islam, M. R., Islam, I. & Dilruba, I. Evolutionary insights into the envelope protein of SARS-CoV-2. (2020) doi:10.20944/preprints202008.0665.v1.