Kromatin immünopresipitasyonu; transkripsiyon faktörlerinin genom boyunca bağlanma bölgelerinin analizleri, düzenleyici mekanizmaların anlaşılması ve yeni düzenleyici yolakların bulunması için gerekli olan yöntemlerden birisidir.

Hücrede proteinler ve DNA arasındaki etkileşimi araştırmak amacıyla kullanılan bir çeşit immünopresipitasyon tekniğidir.

Histon değiştiricilerin hedefini belirterek , çeşitli histon modifikasyonların ilişkili olduğu genomda spesifik olarak konum belirlemeyi amaçlamaktadır.

ChIP deneyleri, çapraz bağlama (crosslinking), nükleik asit kırılması/kesilmesi, jel elektroforezi, gibi birçok moleküler biyoloji ve proteomik metodlarının kullanımını gerektirmektedir. ChIP temel olarak 6 basamakta gerçekleşir.

1. Çapraz Bağlama

Birçok DNA-protein etkileşimleri geçicidir. DNA-protein kompleksini stabile etmeye yönelik olarak in vivo çapraz bağlama gerçekleşir. Bu çapraz bağlamalar kovalent olarak DNA-protein kompleksini stabile etmektedir. Bu durum geçici olan etkileşim komplekslerinin bile analizine imkan vermektedir.

2. Hücre Lizisi

Bu aşamada gerçekleşen hücresel komponentler deterjan içerikli solüsyonla hücre membranını degradasyonu sonucu salınmaktadır. Deterjan ya da tuz uygulamaları DNA-protein kompleksine zarar veremez bunun nedeni; ilk aşamada elde edilen kovalent çapraz bağlama, ChIP uygulaması boyunca kompleksi sabit tutmasıdır.

3. Kromatin Hazırlaması (Kırma/Kesme)

Ekstrasyon aşamasında DNA-protein kompleksi elde edilmektedir. DNA, 200-1000 bp arasında değişiklik gösteren fragmentlere ayrılır. Bu ayrım protein bağlama sekanslarının analizi için gereklidir.

4. İmmünopresipitasyon

Bu adımda ortamdan tüm hücresel materyaller uzaklaştırılarak DNA-protein kompleksi seçici olarak zenginleşir.

Uygun antikorun seçiminde başarılı ChIP analizi için oldukça önemlidir. Hedeflenen proteine uygun nitelikte antikorların bulunmadığı durumlarda HA veya myc füzyon proteinleri eksprese edilebilir ve daha sonra antikorlar, hedefin immünopresipitatif olarak kullanılabilmektedir.

Her ChIP örneğinde fazla miktarda kullanılan tanecikler kompleks dışı maddeleri de etkileyerek spesifik olmayan bağlanmalar oluşturabilmektedir.

5. Çapraz Bağlama Ters Dönüşü ve DNA Saflaştırılması

Bir ChIP testinin spesifik DNA ürünleri amplifiye edilip ölçülmeden önce protein ve DNA arasındaki çapraz bağlantılar tersine çevrilir. Bu tipik olarak geniş ısı inkübasyonları veya protein bileşeninin proteinaz K ile sindirimi yoluyla yapılabilmektedir.

6. DNA’nın Kantitatif Değerlendirilmesi

Gerçekleştirilen tüm adımların sonunda qPCR ile hedef protein-DNA düzeylerinin ölçülmesi gerçekleştirilir.

Kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) teknolojisinde genlerin yoğun oldukları bölgelerde aday genlerin belirlenmesinde hala zorluklar yaşanılan, biyoinformatik ve deneysel zorluklarından ötürü hala tam olarak oturmamış teknolojilerden olmasına rağmen birçok biyolojik sürecin ve hastalıklara karşı çözüm üretecek tedavi adımlarında oldukça fazla katkı sağlayacak metotlardan birisidir.


Kaynak

Ekmekci, S., Abacı, N., Güleç, Ç. and Üstek, D., n.d. ChIP Dizileme Metodu ile Transkripsiyon Faktörü Bağlanma Bölgelerinin saptanması. Deney Tıp Araştırma Ens.Dergisi, 3(6), pp.1-6.

Üstek, D., Abacı, N., Sırma, S. and Çakiris, A., 2022. Yeni Nesil DNA Dizileme. DENEYSEL TIP ARAŞTIRMA ENSTİTÜSÜ DERGİSİ, 1(1), pp.11-18.

Turan, M., n.d. Kromatin Immünopresipitasyon (ChIP) Test Prosedürü. [online] Biyologlar. Available at: https://www.biyologlar.com/kromatin-immunopresipitasyon-chip-test-proseduru [Accessed June 2022].

Bu içeriği paylaşın
Yazar hakkında

Zeynep Tekbaş

Yorumlar

E-posta hesabınız yayımlanmayacak.